SARS-CoV-2, das neu entdeckte Coronavirus, löste Anfang 2020 die globale COVID-19-Pandemie aus. Die Erkrankung wird primär mit Lungenverletzungen in Verbindung gebracht, doch Symptome wie der Verlust von Geruch und Geschmack deuten auf eine breite Tropismus des Virus über verschiedene Gewebe hin. Die frühen Interaktionen zwischen SARS-CoV-2 und Wirtszellen sowie die genauen Eintrittsmechanismen bleiben weitgehend ungeklärt. In unserer Untersuchung von SARS-CoV-2-Infektionen in Gewebekulturen stellten wir fest, dass die Protease TMPRSS2 den Eintrittsweg des Virus maßgeblich bestimmt. Bei Vorhandensein von TMPRSS2 erfolgt die proteolytische Aktivierung des Virus an der Plasmamembran, woraufhin SARS-CoV-2 pH-unabhängig innerhalb von 10 Minuten in die Zellen eindringt. Fehlt TMPRSS2 in Zielzellen, wird das Virus durch Endozytose in Endolysosomen geleitet, aus denen es erst 40–60 Minuten nach Infektion über die säureaktivierte Cathepsin-L-Protease ins Zytosol gelangt. Die Überexpression von TMPRSS2 in Zellen ohne TMPRSS2 hebt die Abhängigkeit vom Cathepsin-L-Weg auf und stellt die Empfindlichkeit gegenüber TMPRSS2-Inhibitoren wieder her. Unsere Ergebnisse zeigen, dass SARS-CoV-2 zwei gegenseitig ausschließende Eintrittsrouten nutzt und unterstreichen die zentrale Rolle von TMPRSS2 bei der Sortierung in den jeweiligen Pfad.
Diese Erkenntnisse sind besonders relevant für die Erforschung von Therapeutika, die den TMPRSS2 SARS-CoV-2-Eintritt blockieren könnten. In Deutschland, wo Institutionen wie die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) solche Studien fördern, gewinnen sie an Bedeutung. Für tiefergehende Einblicke in Bildung und Wissenschaft empfehlen wir ergänzende Ressourcen.
Quantifizierung der SARS-CoV-2-Infektion in Zelllinien
Die Infektionsrate von SARS-CoV-2 variiert stark je nach Zelltyp. In TMPRSS2-exprimierenden Zellen wie Calu-3 und Caco-2 war die Infektion effizienter als in TMPRSS2-negativen Linien wie Vero-Zellen. Durch Western-Blot-Analyse quantifizierten wir TMPRSS2-Level, normalisiert auf EF2. Flow-Zytometrie und qRT-PCR zeigten, dass Caco-2-Zellen höhere Viruslasten und schnellere Replikation aufwiesen. Supernatanten enthielten neue infektiöse Partikel, gemessen per TCID50-Assay. Diese Daten verdeutlichen den Einfluss zellulärer Proteasen auf die Infektivität.
Quantifizierung der SARS-CoV-2-Infektion in Calu-3, Caco-2, A549 und Vero-Zellen
Differentialnutzung von Wirtsproteasen für den infektiösen Eintritt
SARS-CoV-2 nutzt abhängig vom Zelltyp unterschiedliche Proteasen. Inhibitoren wie Aprotinin (TMPRSS2) blockierten die Infektion in Calu-3 und Caco-2 stärker als in Vero-Zellen, während SB412515 (Cathepsin L) Vero-Zellen empfindlicher machte. Zeitabhängige Addition von Inhibitoren nach Bindung bestätigte: TMPRSS2 wirkt früh an der Oberfläche, Cathepsin L später in Endosomen. Dies unterstreicht die dualen Eintrittspfade.
Differentialnutzung von TMPRSS2 und Cathepsin L durch SARS-CoV-2
In fortgeschrittenen Weiterbildung Wissenschaftsmanagement-Programmen werden solche proteolytischen Mechanismen detailliert analysiert.
Abhängigkeit von endosomale Acidifizierung
Ohne TMPRSS2 hängt der Eintritt von niedrigem pH in Endosomen ab. NH4Cl, Chloroquin, Bafilomycin A1 und Concanamycin B reduzierten die Infektion in TMPRSS2-negativen Zellen stärker. Zeitkinetiken zeigten, dass der säureabhängige Schritt 40–60 Minuten nach Erwärmung erfolgt. Rab7a-Mutanten bestätigten die Notwendigkeit reifer Endosomen.
Auswirkungen von Endosomen-Inhibitoren auf SARS-CoV-2-Infektion
TMPRSS2 fördert pH- und Cathepsin-unabhängigen Eintritt
Überexpression von TMPRSS2 in A549-ACE2-Zellen machte den Eintritt unabhängig von Cathepsin L und Bafilomycin. Dies bestätigt, dass TMPRSS2 den Virusweg an die Plasmamembran umleitet und den endosomale Pfad umgeht.
TMPRSS2-Überexpression schaltet Eintritt auf plasmamembranbasiert um
Reife späte Endosomen sind essenziell
Rab7a-Aktivierung und Inhibitoren wie Colcemid oder MG-132 blockierten in TMPRSS2-negativen Zellen. MG-132-sensitive Schritte fielen mit Cathepsin-Aktivität zusammen. In TMPRSS2-positiven Zellen fehlte diese Abhängigkeit.
Rolle reifer Endosomen bei SARS-CoV-2-Eintritt
Proteolytische Verarbeitung triggert Membranfusion
Trypsin- oder Furin-Behandlung spaltete das Spike-Protein und ermöglichte Fusion. Zell-Zell-Fusionsassays zeigten Syncytienbildung in TMPRSS2+ Zellen. Niedriger pH inaktivierte das Virus nicht, sondern war für den cathepsin-Weg nötig.
Proteolytische Aktivierung und Fusion durch SARS-CoV-2
Experten wie Prof. Dr. Heinz Jürgen Voß diskutieren vergleichbare Themen in der Wissenschaft.
Nach proteolytischer Verarbeitung entfällt Endosomenbedarf
Proteasen-aktivierte Viren waren resistent gegen Acidifizierungsinhibitoren und Cathepsin-Hemmer, was den direkten plasmamembranen Eintritt bestätigt.
Unabhängigkeit von Endosomen nach TMPRSS2-Aktivierung
Zusammenfassung und Implikationen
Zusammenfassend nutzt SARS-CoV-2 TMPRSS2 für schnellen, pH-unabhängigen Eintritt an der Oberfläche oder Cathepsin L in Endosomen. Diese Erkenntnisse eröffnen Ansätze für zielgerichtete Inhibitoren, insbesondere in TMPRSS2-exprimierenden Atemwegzellen. Deutsche Forschungsförderung durch DFG und BMBF unterstützt solche Arbeiten entscheidend. Für basale Bildung und Zeitformen Bildung bieten sie wertvolle Grundlagen.
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Quellen
- Stanifer ML et al. (2021). TMPRSS2 expression dictates the entry route used by SARS-CoV-2 to infect host cells. The EMBO Journal, 40(16):e107821. PMC
- Finanziert durch DFG (Heisenberg Program 415089553, LO-2338/3-1) u.a.