Die Alzheimer-Krankheit (AK) ist eine komplexe neurodegenerative Erkrankung, die das Gedächtnis, die Kognition und das Verhalten stark beeinträchtigt. Bestehende Medikamente lindern zwar einige Symptome, gehen aber nicht auf die vielfältigen pathologischen Prozesse ein, die der Krankheit zugrunde liegen. Ein vielversprechender neuer Ansatz konzentriert sich auf die gleichzeitige Hemmung von zwei Schlüsselzielmolekülen: Butyrylcholinesterase (BChE) und p38α-Mitogen-aktivierte Proteinkinase (p38α MAPK). Diese duale Strategie zielt darauf ab, das cholinerge Defizit und die Neuroinflammation, beides Hauptursachen für den neuronalen Verfall bei AK, zu bekämpfen.
Neue Dual-Inhibitoren für die Alzheimer-Therapie
Einleitung: Die Komplexität der Alzheimer-Krankheit
Neurodegenerative Erkrankungen (NDEs) sind gekennzeichnet durch einen fortschreitenden Abbau von Nervenzellen, der zu einer Beeinträchtigung von Gedächtnis, Kognition und Verhalten führt. Aufgrund ihrer multifaktoriellen Natur ist es schwierig, diese komplexen Prozesse mit einem einzelnen Wirkstoff zu beeinflussen. Eine vielversprechende Strategie ist die Entwicklung von Multi-Target Directed Ligands (MTDLs), die mehrere Zielstrukturen gleichzeitig modulieren. Dies kann die Wirksamkeit erhöhen und gleichzeitig Nebenwirkungen und Wechselwirkungen zwischen Medikamenten minimieren, was zu einer besseren Patientenadhärenz führt.
Die Alzheimer-Krankheit (AK), die häufigste NDE, zeichnet sich durch synaptische Dysfunktion, beeinträchtigte Proteinhomöostase und chronische Entzündungen aus. Die erste medikamentöse Behandlung von AK waren Cholinesterasehemmer (ChEIs), die die kognitiven Fähigkeiten von Patienten verbesserten, indem sie den Mangel an Acetylcholin (ACh) ausglichen. Die Forschung hat sich jedoch weiterentwickelt, um auch die zugrunde liegenden pathologischen Merkmale wie Amyloid-β (Aβ) und Tau-Protein-Ablagerungen anzugehen. Trotz intensiver Forschung sind viele Wirkstoffe, die auf Aβ und Tau abzielen, in klinischen Studien gescheitert oder mit Nebenwirkungen verbunden, was die Notwendigkeit neuer MTDL-Kombinationen unterstreicht.
Ein vielversprechendes Ziel für die AK-Behandlung ist die p38α-Mitogen-aktivierte Proteinkinase (p38α MAPK), die durch lösliche oligomere Aβ-Aggregate aktiviert wird. Aktivierte Mikrogliazellen produzieren proinflammatorische Zytokine, die über p38α MAPK eine Hyperphosphorylierung des Tau-Proteins auslösen und so zur Bildung von Tau-Fibrillen beitragen. Darüber hinaus verhindert p38α MAPK den Abbau von β-Sekretase, was zu einer erhöhten Aβ-Produktion führt. Dieser anhaltende neuroinflammatorische Kreislauf wird durch p38α MAPK aufrechterhalten und verstärkt.
Während die Acetylcholinesterase (AChE) bei AK-Patienten eine verminderte Aktivität aufweist, steigt die Aktivität der Butyrylcholinesterase (BChE) signifikant an, insbesondere im Hippocampus und Kortex. BChE-Hemmer zeigen im Vergleich zu AChE-Hemmern oder gemischten ChEIs potenzielle Vorteile, da sie weniger periphere parasympathische Nebenwirkungen verursachen und sogar Aβ-Spiegel reduzieren können.
Obwohl einige neuere AK-Medikamente vielversprechende biochemische Signalwege modulieren, bleiben sie bei der Linderung kognitiver Beeinträchtigungen zurück. Dies unterstreicht die Bedeutung der Wiederherstellung der cholinergen Signalübertragung durch ChEIs. Gleichzeitig spielt p38α-MAPK eine zentrale Rolle in mehreren AK-Hypothesen, insbesondere bei der Neuroinflammation, die eine Hauptursache für gestörte cholinerge Signalübertragung ist. Bislang gibt es keine Studien, die die gleichzeitige Hemmung dieser beiden Enzyme mit synergistischen Effekten bei der AK-Pathophysiologie belegen. Basierend auf den Ergebnissen der Forschung an separaten Zielen und der theoretischen Machbarkeit der Bindungsstellen besteht jedoch die Hypothese, dass eine duale BChE/p38α MAPK-Hemmung einen neuen Ansatz zur Bekämpfung der komplexen Wechselwirkungen pathologischer Signalwege bei AK darstellen könnte.
Die Integration von zwei pharmakophoren Strukturgerüsten in ein MTDL kann durch Verschmelzung, Kontinuität oder einfache Fusion über einen Linker erreicht werden. Typ-I-p38α-MAPK-Inhibitoren weisen konsistente Strukturmerkmale auf: ein sechsgliedriger Heterocyclus mit einem Heteroatom (Sauerstoff oder Stickstoff), das eine Wasserstoffbrücke mit dem Amid-Stickstoff von Met109 in der Hinge-Region von p38α MAPK bildet. Zusätzlich besetzt ein aromatisches Fragment die hydrophobe Region I (HRI), während ein fünfgliedriger Heterocyclus mit der Asp168-Phe169-Gly170 (DFG)-Tasche interagiert.
Die Molekulardockings von Typ-I-p38α-MAPK-Inhibitoren in die aktive Stelle von hBChE zeigten, dass sie alle primären Bindungstaschen besetzen können. Der sechsgliedrige Heterocyclus befindet sich in der Acyl-Bindungstasche, der aromatische Ring erstreckt sich zum peripheren anionischen Standort (PAS), und der fünfgliedrige Heterocyclus kann mit der Cholin-Bindungstasche interagieren, wenn er mit einer basischen funktionellen Gruppe substituiert ist. Basierend auf diesen strukturellen Erkenntnissen verfolgte unsere Arbeitsweise einen kombinierten pharmakophoren Ansatz, der von bekannten Gerüsten von Typ-I-p38α-MAPK-Inhibitoren ausging – dieselbe Strategie, die für alle derzeit bekannten MTDLs verwendet wird, die auf p38α MAPK zusammen mit einem anderen Enzym abzielen.
Eine schematische Darstellung der Bindungsmodi von Verbindungen in den aktiven Zentren
Hierzu gehören beispielsweise SB202190 und SP600125, die als duale p38α-MAPK/JNK-Inhibitoren wirken, und Pexmetinib, ein dualer p38α-MAPK/Tie-2-Inhibitor. Während diese Liganden hauptsächlich zur Krebsbehandlung untersucht werden, entwickelten Koch und Kollegen Dual-p38α-MAPK/GSK-3β-Inhibitoren mit geringem Nanomol-Bereich, die das Potenzial haben, neuroinflammatorische Prozesse bei AK zu bekämpfen. Neuroinflammation ist auch ein Hauptmerkmal der Lewy-Körper-Demenz, für die Neflamapimod, ein selektiver p38α/β-MAPK-Inhibitor, derzeit in Phase-IIb-Klinikversuchen evaluiert wird. Darauf aufbauend integrierten Bolognesi und Kollegen erfolgreich eine Propargylamin-Einheit in das Neflamapimod-Gerüst, was zu einem dualen p38α-MAPK/MAO-B-Liganden mit neuroprotektiven Eigenschaften in Neuronen unter toxischer Belastung führte. In Anlehnung an diese innovativen Ansätze präsentieren wir hier eine neue Reihe von p38α-MAPK-zielgerichteten Hybriden, die für neurodegenerative Erkrankungen entwickelt wurden.
Hypothese zur Entwicklung eines dualen hBChE/p38α MAPK-Inhibitors
In dieser Arbeit beschreiben wir das Design, die Synthese und die umfassende biologische Bewertung von erstklassigen MTDLs, die sowohl auf BChE als auch auf p38α MAPK abzielen. Nach der Synthese der neuartigen dualen BChE/p38α-MAPK-Inhibitoren erhielten wir Röntgenkristallstrukturen der vielversprechendsten Moleküle, die an beide Enzyme gebunden waren, und unterzogen sie In-vitro-, In-vivo- und Ex-vivo-Assays, bei denen sie pro-kognitive und entzündungshemmende Wirkungen zeigten.
Ergebnisse und Diskussion: Entdeckung und Optimierung
Entdeckung und Optimierung des dualen hBChE/p38α MAPK-Trefferinhibitors
Um unsere Arbeitsweise für die Entwicklung dualer hBChE/p38α-MAPK-Inhibitoren zu testen, nutzten wir zunächst einen computergestützten Workflow zur Identifizierung von Trefferverbindungen. Eine Bibliothek von 172 kommerziell erhältlichen p38α-MAPK-Inhibitoren wurde aus den Datenbanken ChEMBL und PDB extrahiert und in die aktive Stelle von hBChE docked. Die erhaltenen Treffer wurden geclustert und visuell inspiziert, um die Besetzung der Acyl-Bindungstasche von hBChE und das Vorhandensein einer Kation-π-Interaktion mit Trp82 in der Cholin-Bindungstasche zu prüfen. Acht strukturell unterschiedliche Verbindungen wurden erworben und In-vitro-Tests auf Aktivität gegen rekombinantes hBChE und rekombinantes menschliches p38α-MAPK mittels der modifizierten Ellman-Methode bzw. des ADP-Glo-Assays ausgewertet. ARRY-371797, ein oral bioverfügbarer p38α-MAPK-Inhibitor von Pfizer, zeigte als einzige Verbindung das gewünschte inhibitorische Profil mit IC50-Werten von 12,0 μM und 0,13 μM für hBChE bzw. p38α-MAPK.
Entdeckung und Optimierung von ARRY-371797
Docking- und Molekulardynamiksimulationen (MD) wurden verwendet, um die mutmaßlichen Bindungsmodi von ARRY-371797 in den aktiven Zentren von hBChE und p38α-MAPK vorherzusagen. Für hBChE ordnete das Docking die 2,4-Difluorphenoxy-Einheit von ARRY-371797 in die Acyl-Bindungstasche, die N,N-Dimethylethyl-Einheit in Richtung der Cholin-Bindungstasche und die Isobutylkette in Richtung von Trp82 und Trp430. MD-Simulationen deuteten auf eine mögliche π-π-Interaktion der positiv geladenen N,N-Dimethylethyl-Einheit mit Trp82 hin. Für p38α-MAPK sagte das Docking eine Schlüsselwasserstoffbrücke des N2-Indazol-Stickstoffs von ARRY-371797 mit Met109 der Hinge-Region voraus, die Besetzung der HRI durch die 2,4-Difluorphenoxy-Gruppe und der hydrophoben Region II (HRII) durch die Isobutylgruppe. Die N,N-Dimethylethyl-Einheit war zum Lösungsmittel orientiert und bildete Wechselwirkungen mit Asp168 in der DFG-Tasche. In MD bildete das N,N-Dimethylethylamid Wasserstoffbrücken über Wasserbrücken mit Asp168 und Val30 sowie eine Kation-π-Interaktion mit Tyr35.
Somit bot die Trefferverbindung ARRY-371797 drei modifizierbare Stellen: die Isobutylgruppe, die 2,4-Difluorphenoxy-Gruppe und die Amid-Einheit. Durch Austausch der 2,4-Difluorbenzol-Gruppe gegen sperrigere aromatische Ringe oder Einführung von Benzyl- und Thiophenyl-Einheiten wurde deren Einfluss auf die Bindung an die Acyl-Bindungstasche von hBChE und die Besetzung der HRI von p38α-MAPK evaluiert. Unterschiedliche Alkylsubstituenten wurden an den N1- und N2-Stickstoffatomen des Indazols eingeführt, um zu untersuchen, wie die Besetzung der HRII von p38α-MAPK die Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SARs) der Inhibitoren beeinflusst. Schließlich wurden tertiäre Amine unterschiedlicher Länge und Stickstoffheterozyklen in die Amid-Gruppe eingeführt, um die Wechselwirkungen mit der DFG-Tasche von p38α-MAPK und der PAS von hBChE zu erforschen.
Die am häufigsten vorkommenden Docking-Posen und Modifikationen von ARRY-371797
Synthese und In-vitro-Bewertung neuer BChE/p38α-MAPK-Dual-Inhibitoren
Der allgemeine Syntheseweg für die meisten ARRY-371797-Analoga besteht aus zwei konvergierenden Routen. Nach der Nitrierung von Verbindung 1 entstand das Nitrobenzoesäurederivat 2, das durch Veresterung geschützt wurde. Die Verbindungen 4-9 wurden durch nukleophile aromatische Substitution mit Phenolen und Thiophenolen erhalten. Nach Reduktion der Nitrogruppe wurden die Indazole 16-21 und 23 durch Ringschluss synthetisiert. Verbindung 39 wurde durch Negishi-Kupplung hergestellt. Die Alkylierung der Indazole erfolgte über eine SN2-Reaktion. Nach Verseifung der Carbonsäureester wurden die Amide 72-96 und 97-109 mittels TBTU als Kopplungsreagenz synthetisiert.
Allgemeine Syntheseroute
Alle Endverbindungen wurden auf ihre In-vitro-Enzyminhibitoraktivität gegen hAChE, hBChE und humanes p38α-MAPK getestet. Liganden mit einer Restaktivität von mehr als 50% bei einer Konzentration von 100 μM wurden als inaktiv eingestuft.
Strukturen und In-vitro-Potenzen
Kinase-Selektivität, Struktur-Wirkungs-Beziehungen und Kristallstrukturen der Verbindungen 94 und 95
Die Verbindungen 94 und 95 zeigten eine ausgewogene sub-micromolare inhibitorische Potenz gegenüber hBChE und p38α-MAPK, während sie AChE bei einer Konzentration von 100 μM nicht hemmten. Dies war ein wichtiges Ziel zur Minimierung potenzieller Nebenwirkungen. In weiteren Tests zeigten beide Verbindungen eine hohe Selektivität für p38α-MAPK im Vergleich zu einem Panel von 103 Kinasen.
Die Kristallstrukturen von Verbindungen 94 und 95 im Komplex mit hBChE zeigten identische Bindungsmodi. Obwohl diese N1-alkylierten Indazole die Acyl-Bindungstasche nicht besetzen, zeigen sie dennoch eine potente hBChE-Inhibition. Die tertiäre Aminogruppe bildet eine Kation-π-Interaktion mit Trp82. Eine Substitution der N,N-Dimethylethylaminogruppe mit größeren funktionellen Gruppen verbessert die BChE-Inhibition, jedoch nur bei N2-alkylierten Indazolen wie Verbindung 102.
Kristallstrukturen von Verbindungen 94 und 95 mit hBChE und p38α MAPK
Die Bindung von Verbindungen 94 und 95 an humanes p38α-MAPK entsprach dem Bindungsmodus bekannter p38α-MAPK-Inhibitoren. Der N2-Stickstoff des Indazols bildet eine Wasserstoffbrücke mit Met109. Die sperrigen Isobutyl- und Cyclohexylmethyl-Gruppen besetzen die HR II. Die 2,4-Difluorbenzol-Gruppe befindet sich in der HR I. Der optimale Abstand zwischen dem Wasserstoffbrückendonor am Indazolkern und der 2,4-Difluorbenzyl-Gruppe ermöglicht eine exquisite Selektivität gegenüber den strukturell und phylogenetisch eng verwandten Kinasen. Die Amidgruppe ist entscheidend für eine effektive Hemmung von p38α-MAPK, da sie als Wasserstoffbrückendonor mit Asp168 der DFG-Tasche interagiert.
In-vitro-Zytotoxizität, Pharmakokinetik und entzündungshemmende Wirkungen
Zytotoxizitätsstudien an verschiedenen Zelllinien zeigten, dass die Verbindungen 94 und 95 die Zellviabilität in den getesteten Konzentrationen nicht beeinträchtigten. Die neuroprotektive und glioprotektive Wirkung wurde ebenfalls evaluiert. Vorhersagen zur Blut-Hirn-Schranken-Penetration mittels PAMPA zeigten eine hohe passive Permeabilität für beide Verbindungen, vergleichbar mit zugelassenen ChEIs. Die Stabilität in menschlichen Lebermikrosomen deutete auf eine hohe metabolische Stabilität der Verbindungen hin.
Die entzündungshemmende Wirkung der dualen BChE/p38α-MAPK-Inhibitoren wurde in einem In-vitro-Assay mit peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) untersucht. Beide Verbindungen 94/95 und Neflamapimod zeigten eine signifikante Hemmung der Produktion proinflammatorischer Zytokine. Gleichzeitig wurde die Produktion des entzündungshemmenden Zytokins IL-12 erhöht, was mit früheren Befunden übereinstimmt, dass die p38-MAPK-Hemmung die IL-12-Produktion fördern kann.
Effekt auf die Zytokinproduktion in PBMCs
In-vivo- und Ex-vivo-Studien: Verhaltensaufgaben
Zur Evaluierung der pro-kognitiven Eigenschaften der Verbindungen 94 und 95 wurden zwei Mausmodelle für kognitive Beeinträchtigungen eingesetzt: das Skopolamin-Modell (cholinerges Defizit) und das LPS-Modell (Neuroinflammation). In beiden Modellen zeigten die Verbindungen 94 und 95 in höheren Dosen eine signifikante Verbesserung der kognitiven Funktionen, die sich in verlängerten Latenzzeiten bei passiver Vermeidung und erhöhter Präferenz für neue Objekte im NOR-Test äußerte. Im Vergleich zu Rivastigmin zeigten die Verbindungen 94 und 95 eine deutlichere und anhaltendere Wirksamkeit.
Im LPS-Modell des Morris-Wasser-Labyrinths (MWM) zeigten die Verbindungen 94 und 95 eine signifikant reduzierte Fluchtlatz und eine bessere Erinnerungsleistung im Vergleich zu Rivastigmin. Ex-vivo-Analysen der Gehirne von LPS-behandelten Mäusen zeigten, dass die Behandlung mit den Verbindungen 94/95 und Rivastigmin zu einer signifikanten Reduzierung der entzündungsbezogenen Proteine TLR4, COX-2 und NLRP3 führte, was die neuroprotektive Rolle der Verbindungen unterstreicht.
Effekt auf kognitive Defizite im passiven Vermeidungs-Test
Effekt auf kognitive Defizite im NOR-Test
Strukturen und In-vitro-Potenzen
Effekt auf die Gedächtniskonsolidierung im Morris-Wasser-Labyrinth
Effekt auf entzündungsbezogene Proteine im Gehirn
Pharmakokinetik-Studie
Die Pharmakokinetik der Verbindungen 94 und 95 wurde in Mausmodellen untersucht. Beide Verbindungen zeigten eine schnelle Absorption und Verteilung im Gehirn. Die Eliminationshalbwertszeiten waren relativ lang, und die Konzentrationen im Gehirn überschritten die in-vitro-IC50-Werte für mindestens 60 Minuten, was eine systemische Wirkung nahelegt. Im Vergleich dazu zeigten die Referenzverbindungen unterschiedliche pharmakokinetische Profile, wobei Rivastigmin eine schnellere Clearance aufwies, während Neflamapimod eine längere Präsenz im Gewebe zeigte.
Konzentration über die Zeit für Verbindung 94 und 95
Schlussfolgerung: Ein vielversprechender Ansatz für die Alzheimer-Behandlung
Die strukturbasierte Entwicklung von MTDLs, die gleichzeitig p38α-MAPK und hBChE hemmen, führte zur Identifizierung und Optimierung der ersten dualen Inhibitoren dieser beiden AK-relevanten Zielenzyme. Diese neuartigen Verbindungen, insbesondere 94 und 95, zeigten in In-vitro- und In-vivo-Studien vielversprechende pro-kognitive und entzündungshemmende Wirkungen. Ihre Fähigkeit, kognitive Defizite zu verbessern und entzündliche Prozesse im Gehirn zu reduzieren, macht sie zu vielversprechenden Leitkandidaten für die Behandlung der Alzheimer-Krankheit. Die duale Wirkungsstrategie in einem Molekül könnte sich als wirksamer erweisen als Ansätze mit nur einem Wirkmechanismus.
Experimenteller Teil
Chemie
Die Synthese der Verbindungen umfasste mehrere Schritte, beginnend mit der Modifizierung von Ausgangsverbindungen wie Methyl-2-fluor-4-methylbenzoat und Methyl-5-amino-2-brom-4-methylbenzoat. Es wurden verschiedene Kupplungsreaktionen (Suzuki, Negishi), Alkylierungen und Amidbildungen durchgeführt, um die Zielmoleküle zu synthetisieren. Die Reinigung und Charakterisierung der Verbindungen erfolgte mittels Säulenchromatographie, LC-MS und NMR-Spektroskopie.
Computergestützte Studien
Computergestützte Studien wurden zur Vorhersage von Bindungsmodi und zur Optimierung der Wirkstoffentwicklung eingesetzt. Molekulare Docking- und MD-Simulationen wurden auf Basis von Kristallstrukturen von hBChE und p38α-MAPK durchgeführt.
In-vitro-Enzymatische Aktivitätsstudien
Die Hemmung von hAChE, hBChE und humanem p38α-MAPK wurde mittels etablierter Assays bestimmt. Die Selektivität gegenüber anderen Kinasen wurde ebenfalls bewertet.
Zellkulturen und biologische Studien
Humanzelllinien (HepG2, SH-SY5Y) und murines Mikroglia (BV2) wurden für Zytotoxizitäts-, neuroprotektive und entzündungshemmende Studien verwendet. PBMCs wurden zur Untersuchung der Zytokinproduktion eingesetzt.
In-vitro-physiko-chemische und In-vivo-Pharmakokinetik-Studien
Physiko-chemische Eigenschaften wie Log D und Blut-Hirn-Schranken-Penetration wurden evaluiert. Pharmakokinetische Studien in Mäusen wurden durchgeführt, um die Exposition im Serum und Gehirn zu bestimmen.
Ex-vivo-Assays
Western-Blot-Analysen wurden zur Untersuchung der Expressionsniveaus von Entzündungsmarkern im Gehirn nach der Behandlung eingesetzt.
Datenanalyse
Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism durchgeführt, um die Ergebnisse aus In-vivo- und Ex-vivo-Studien auszuwerten.
Danksagungen und Glossar
Die Autoren danken den Förderorganisationen und technischen Unterstützungsgruppen für ihre Beiträge zu dieser Arbeit. Ein Glossar der verwendeten Abkürzungen ist enthalten.
Referenzen
Die detaillierte Liste der Referenzen ist im Originalartikel zu finden.
Zugehörige Daten und ergänzendes Material
Ergänzende Materialien und Daten sind online verfügbar.